Биофармацевтикалық препараттарға арналған эндотоксинді анықтау шешімдері
Биофармацевтикалық препараттарға арналған эндотоксинді анықтау шешімдері
БЕТМАТЖобаның тарихы және негізгі қиындықтары
Биофармацевтикалық препараттар дегеніміз - гендік инженерия және жасушалық инженерия сияқты биотехнология құралдарымен өндірілетін дәрілік заттар, соның ішінде моноклоналды антиденелер, рекомбинантты ақуыздар, вакциналар, жасушалық терапия өнімдері, қан препараттары және т.б. Бұл дәрілік заттар адамның иммундық жүйесіне немесе қан айналым жүйесіне тікелей әсер етеді және олардың эндотоксинмен ластануға сезімталдығы химиялық препараттарға қарағанда әлдеқайда жоғары. Тіпті 0,1 ЕС/кг эндотоксин дозасы қызба, анафилактикалық шок және тіпті көп мүшелі жеткіліксіздік сияқты ауыр жағымсыз реакцияларды тудыруы мүмкін.
Фармацевтикалық сумен салыстырғанда, биофармацевтикалық препараттардың эндотоксинін анықтау үш негізгі қиындыққа тап болады: ① Үлгінің құрамы күрделі, құрамында жоғары концентрациялы ақуыздар (мысалы, моноклоналды антидене концентрациясы 100 мг/мл дейін), беттік белсенді заттар (мысалы, полисорбат 80), буферлік тұздар (мысалы, Tris, фосфат) және т.б. бар, олар Limulus Amebocyte Lysate (LAL) реакциясына кедергі келтіруі мүмкін; ② Эндотоксин шектері әртүрлі сорттар арасында айтарлықтай өзгереді (мысалы, вакциналар әдетте ≤ 10 EU/доза, моноклоналды антиденелер ≤ 0,5 EU/мг), жоғары сезімталдықты анықтау әдістерін қажет етеді; ③ Кейбір биофармацевтикалық препараттар (мысалы, жасуша терапиясы өнімдері) тұрақсыз және жоғары температура мен экстремалды рН сияқты алдын ала өңдеуге төтеп бере алмайды, бұл кедергіні жоюдың қиындығын арттырады.
Фармакопея стандарттарына сәйкес, бұл шешім биофармацевтикалық препараттардың сипаттамаларына негізделген «әдісті валидациялау - үлгіні өңдеу - анықтауды енгізу - сапаны бақылау» үшін шешім ұсынады, бұл анықтау нәтижелерінің дәлдігін, сәйкестігін және сенімділігін қамтамасыз етеді.
The эндотоксин шегі Биофармацевтикалық препараттардың мөлшері енгізу жолына, мөлшеріне, дәрілік заттың клиникалық қолданылуына және Адамға арналған фармацевтикалық препараттарға қойылатын техникалық талаптарды үйлестіру жөніндегі халықаралық кеңестің (ICH) Q6B нұсқауларына сәйкес белгіленуі тиіс. Негізгі есептеу формуласы келесідей:
L = K/M
Мұндағы: L – эндотоксин шегі (EU/мл немесе EU/мг); K – сағатына дене салмағының килограммына шаққандағы ең жоғары көтерімді эндотоксин дозасы (көктамыр ішіне енгізу үшін K = 5 EU/кг·сағ; интратекальды енгізу үшін K = 0,2 EU/кг·сағ); M – сағатына дене салмағының килограммына шаққандағы препараттың ең жоғары дозасы (мл/кг·сағ немесе мг/кг·сағ).
Эндотоксин шектеулері және кең таралған биофармацевтикалық препараттарға қойылатын стандартты талаптар
Дәрілік зат санаты | Өкілдік өнімдер | Эндотоксинге қойылатын шектеу талабы | Басқару бағыты |
Моноклоналды антиденелер | Пембролизумаб | ≤ 0,5-2 ЕС/мг | Көктамыр ішіне енгізу, тері астына енгізу |
Рекомбинантты ақуыздар | Рекомбинантты адам инсулині, өсу гормоны | ≤ 0,01-0,1 ЕО/U | Тері астына енгізу, көктамыр ішіне енгізу |
Вакциналар | Белсенді емес COVID-19 вакцинасы, В гепатитіне қарсы вакцина | ≤ 1-10 ЕС/доза | Бұлшықет ішіне, тері астына енгізу |
Қан өнімдері | Адам сарысуындағы альбумин, иммуноглобулин | ≤ 0,5 ЕС/мл | Көктамыр ішіне енгізу |
Жасуша терапиясы өнімдері | CAR-T жасуша препараттары | Пациенттің дене салмағының ≤ 0,06 ЕС/кг | Көктамыр ішіне енгізу |
Ескерту: «Доза» бір реттік енгізу дозасын, ал «U» биологиялық белсенділік бірлігін білдіреді. Нақты шек дәрілік затбелгімен және тіркеуді бекіту талаптарымен бірге расталуы керек.
Анықтау әдістерін таңдау және үйлесімділікті талдау
The эндотоксин анықтау Биофармацевтикалық препараттарды өндіру әлі де негізінен фармакопея бекіткен гель-ұю әдісіне, фотометриялық әдіске (турбидиметриялық әдіс/хромогендік әдіс) сүйенеді, бірақ үйлесімді әдіс үлгі сипаттамаларына (мысалы, ақуыз концентрациясы, интерференция дәрежесі, сезімталдық талабы) сәйкес таңдалуы керек. Соңғы жылдары рекомбинантты фактор С (rFC) әдісі биофармацевтикалық препараттарды анықтауда күшті антиинтерференциялық қабілеті мен жоғары ерекшелігіне байланысты жиі қолданылып келеді.
Үш негізгі әдістің үйлесімділігін салыстыру
Анықтау әдісі | Негізгі қағида | Артықшылықтары | Шектеулер | Үйлесімді биофармацевтикалық түрлері |
Гель-ұйытылған әдіс | LAL мен эндотоксин арасындағы реакция гель түзеді | ① Қарапайым пайдалану; ② Арнайы жабдық қажет емес | ① Дәл сандық бағалау мүмкін емес, тек шекті тестілеуге ғана қолданылады | Эндотоксин шығарылғанға дейін соңғы өнімдерді анықтауды шектейді |
Хромогендік әдіс | Хромогендік субстраттың гидролизі түрлі-түсті өнімдерді түзеді | ① Сандық бағалауға қабілетті, трендтерді талдауды жеңілдетеді; ② Күшті кедергіге қарсы қабілет | ① Құралдар мен реагенттердің жоғары құны | Моноклоналды антиденелер және рекомбинантты ақуыздар сияқты өнімдерді анықтау (интерференцияны жою үшін алдын ала өңдеуді қажет етеді) |
rFC әдісі | Эндотоксинмен әрекеттесетін рекомбинантты Лимулус реагенті | ① Жоғары ерекшелік (тек эндотоксинмен әрекеттеседі, глюканмен емес); ② Жануарлардың ресурстарына тәуелділік жоқ | ① Кейбір фармакопеялармен әлі танылмаған | Глюкан, жасуша терапиясы өнімдерін қамтуы мүмкін үлгілер (әдістің орындылығын тексеру қажет) |
Анықтау әдістерін таңдау
1-қадам: Анықтау мақсатын нақтылаңыз
● «Сәйкестік шегін тексеру» үшін: гель-ұйынды әдісіне немесе хромогендік әдіске басымдық беріңіз;
● «Өндіріс процесіндегі сандық мониторинг» үшін: Хромогендік әдіске немесе rFC әдісіне басымдық беріңіз;
● «Құрамында глюкан бар үлгілер» үшін: rFC әдісіне басымдық беріңіз.
2-қадам: Үлгі интерференциясының дәрежесін бағалаңыз
● Төмен интерференция (ақуыз концентрациясы
● Орташа және жоғары интерференция (ақуыз концентрациясы 10-100 мг/мл, құрамында полисорбат бар): Хромогендік әдіс (алдын ала өңдеуді қажет етеді);
● Өте жоғары интерференция (ақуыз концентрациясы > 100 мг/мл, құрамында күрделі қосымша заттар бар): rFC әдісі.
3-қадам: Сезімталдық талабын сәйкестендіріңіз
● Шек ≤ 0,1 EU/мл: Хромогендік әдісті (анықтау шегі 0,001 EU/мл) немесе rFC әдісін таңдаңыз;
● Шектеу > 0,1 ЕУ/мл: Гель-ұйықтау әдісі талапты қанағаттандыра алады.
Ерекше өзгешеліктері
-
Жалпы алдын ала емдеу әдістері және қолданылатын сценарийлер
Алдын ала өңдеу әдісі
Принцип
Операциялық қадамдар
Қолданылатын үлгі түрлері
Сақтық шаралары
Сұйылтылу әдісі
Кедергі келтіретін заттардың концентрациясын кедергі келтірмейтін деңгейге дейін төмендетіңіз
Үлгіні LAL реагент суымен ақуыз концентрациясы
Орташа және төмен ақуыз концентрациясы бар үлгілер (мысалы, рекомбинантты инсулин)
Сұйылтылу коэффициентін тексеру қажет (қалпына келтіру деңгейі 50%-200%)
Ақуызды тұндыру әдісі
Ақуыздарды күшті қышқыл/органикалық еріткіштермен тұндыру
1. Үлгіні 10% трихлорсірке қышқылымен 1:1 қатынасында араластырыңыз және оны 4°C температурада 30 минутқа қойыңыз; 2. 10 000 айн/мин жылдамдықпен 10 минут центрифугалаңыз; 3. Анықтау үшін үстіңгі қабатты алыңыз
Жоғары концентрациялы моноклоналды антиденелер, қан препараттары
Эндотоксиннің тұнбасына әкелетін шамадан тыс центрифугалаудан аулақ болыңыз
Ультрафильтрация әдісі
Ультрафильтрация мембранасы ақуыздарды сақтайды, ал эндотоксин өтеді
1. Үлгіні 30 кДа эндотоксинсіз ультрафильтрациялық центрифуга түтігіне қосыңыз; 2. 4000 айн/мин жылдамдықпен 15 минут бойы центрифугалаңыз; 3. Анықтау үшін сүзіндіні жинаңыз
Макромолекулалық ақуыз үлгілері (мысалы, молекулалық салмағы > 50 кДа болатын моноклоналды антиденелер)
Ультрафильтрация мембранасын LAL реагент суымен алдын ала 3 рет шайыңыз
Интерференция ингибиторларын қосу
Ингибиторлар кедергі келтіретін заттармен бірігіп, эндотоксин бөледі
Реакция жүйесіне 0,5%-1% соңғы концентрацияға дейін интерференция ингибиторын (мысалы, полиэтиленгликоль 6000) қосыңыз.
Беттік белсенді заттардан тұратын үлгілер (мысалы, Tween 80 бар вакциналар)
Ингибитордың LAL мен эндотоксин арасындағы реакцияға әсер етпейтінін тексеру қажет.
Хроматографиялық тазарту әдісі
Аффиндік хроматография арқылы ақуыздарды алып тастаңыз
Эндотоксинді эндотоксин аффинділік бағанымен адсорбциялаңыз, элюциялаңыз, содан кейін анықтаңыз
Өте жоғары интерференциясы бар үлгілер (мысалы, CAR-T жасушаларының үстіңгі қабаты)
Жоғары құны, тек ғылыми-зерттеу және тәжірибелік-конструкторлық жұмыс кезеңінде қолданылады
-
Кедергілерді тексеру сынағы
Алдын ала емдеудің тиімділігін қамтамасыз ету үшін барлық биофармацевтикалық препараттарды анықтамас бұрын араласуды тексеру жүргізілуі керек. Қадамдар келесідей:
1. Үлгі тобын дайындаңыз: Алдын ала өңдеусіз сынақ үлгісі;
2. Шпиктелген топты дайындаңыз: Сынақ үлгісіне белгілі концентрациядағы эндотоксинді (мысалы, 0,1 ЕС/мл) қосыңыз;
3. Екі топтың эндотоксин концентрацияларын сәйкесінше анықтаңыз және қалпына келу жылдамдығын есептеңіз: Қалпына келу жылдамдығы = (Шикіленген топтың концентрациясы - Үлгі тобының концентрациясы) / Экзогенді қосылған эндотоксин концентрациясы × 100%
4. Бағалау стандарты: Егер қалпына келтіру деңгейі 50%-200% аралығында болса, бұл ешқандай кедергі жоқ екенін білдіреді; әйтпесе, алдын ала емдеу әдісін оңтайландыру қажет.
(1) Анықтау алдындағы дайындық
1. Үлгіні дайындау: 100 мг/мл моноклоналды антидене үлгісін алып, оны LAL реагент суымен 50 мг/мл дейін сұйылтыңыз;
2. Реагентті дайындау: BETMAT KCA эндотоксинді талдау жинағы (кинетикалық хромогендік әдіс) 300 сынақ/жинақ, каталог нөмірі KCA300TB. Жиынтыққа мыналар кіреді: Хромогендік LAL реагенті, қалпына келтіру буфері, бақылау стандартты эндотоксині, LAL реагенті суы;
3. Құралды дайындау: ① Кинетикалық инкубациялық микропластина оқу құралы ELx808IUBET, каталог нөмірі: 808IUBET; ② Эндотоксинсіз шыны сұйылту түтікшелері; ③ Эндотоксинсіз ұштары бар пипеткалар; ④ Эндотоксинсіз 96 ұяшықты микропластиналар; ⑤ Vortex араластырғышы; ⑥ Сынақ түтігінің сөресі.
(2) Анықтау қадамдары
Стандартты қисықты дайындау
1. Эндотоксин стандартын LAL реагент суымен 0,001, 0,01, 0,1, 1 және 10 EU/мл концентрацияларына дейін сұйылтыңыз;
2. 96 ұңғымалы пластинаның әрбір ұңғымасына 100 мкл стандарт қосыңыз, әрбір концентрация үшін 3 параллель ұңғыма орнатыңыз;
3. Әрбір ұяшыққа 100 мкл хромогенді LAL реагентін қосыңыз;
4. Пластинаны инкубациялық микропластина оқу құралына салып, 37°C температурада 120 минут инкубациялаңыз. 405 нм толқын ұзындығында сіңірудің өзгерісін өлшеңіз, OD405 нм-ді әр 30 секунд сайын оқып, стандартты қисық сызықты құрыңыз (R² ≥ 0,99).
Үлгіні анықтау
1. Сұйылтылған моноклоналды антидене үлгісінің 100 мкл мөлшерін анықтау ұяшықтарына қосыңыз (2 параллель ұяшық + 2 бос бақылау ұяшықтары жиынтығы);
2. Стандартты қисықтың инкубация және оқу қадамдарын қайталаңыз;
3. Стандартты қисық бойынша үлгінің эндотоксин концентрациясын есептеңіз және бастапқы концентрацияны алу үшін сұйылту коэффициентіне көбейтіңіз.
Кедергілерді тексеру
1. Шпиктелген топтың қалпына келу жылдамдығы (үлгі + 0,1 EU/мл эндотоксин) 85% құрайды, бұл 50%-200% талабына сәйкес келеді, сондықтан ешқандай кедергі жоқ екені анықталды.
Нәтижелерді бағалау және есеп беру
1. Бағалау стандарты: Егер үлгінің эндотоксин концентрациясы ≤ шекті болса (мысалы, моноклоналды антиденелер ≤ 1 EU/мг) және интерференцияны тексеру білікті болса, үлгі «білікті» деп бағаланады;
2. Есептің негізгі мазмұны: «Алдын ала өңдеу әдісі» және «араласуды тексеру нәтижесі» көрсетілуі керек.
(I) Зертханалық сапаны бақылаудың (СБ) негізгі тұстары
Реагент сапасын бақылау
1. Реагенттердің әрбір жаңа партиясы үшін «сезімталдықты тексеру (гель-ұю әдісі)» немесе «стандартты қисықтың жарамдылығын тексеру (фотометриялық әдіс немесе rFC әдісі)» жүргізілуі керек: реагенттің нақты сезімталдығын анықтау үшін стандартты пайдаланыңыз, ол нұсқаулыққа сәйкес келуі керек;
2. Үлгіде глюкан сияқты кедергі келтіретін заттар болуы мүмкін болған кезде, реагенттің «ерекшелігін» тексеру қажет: глюкан сияқты кедергі келтіретін заттарды қосып, жалған оң реакция жоқ екенін растаңыз.
Операциялық процесті басқару
1. «Оң бақылау (ДБ)» және «Теріс бақылау (ТБ)» параметрлерін орнатыңыз:
● ДК: Эндотоксин стандарты (реагенттің тиімділігін қамтамасыз ету үшін);
● NC: LAL реагент суы (айқаспалы ластанудың болмауын қамтамасыз ету үшін);
2. Параллель үлгілердің салыстырмалы ауытқуы ≤ 10% болуы керек (фармацевтикалық су үшін 15% стандартынан қатаңырақ).
Құралды калибрлеу
● Микропластиналы оқу құрылғысын жылына бір рет калибрлеу керек (толқын ұзындығы мен сіңіру дәлдігі);
● Пипетка тоқсанына бір рет калибрленуі керек (көлем қателігі ≤ 5%).
(II) Өндірістік процестің тәуекелдерін басқару
1. Шикізатты бақылау: қоректік орта, сарысу және тазарту бағанасы сияқты шикізаттың эндотоксинін анықтау керек, оның шегі ≤ 0,01 EU/мл болуы керек;
2. Процесті басқару: Тазарту процесіне «эндотоксинді жою қадамын» қосыңыз (мысалы, анион алмасу хроматографиясы, эндотоксин адсорбциясының аффинділік хроматографиясы);
3. Қоршаған ортаны бақылау: Өндірістік цехтың А класты аймағының (толтыру аймағының) ауасындағы эндотоксин ≤ 0,03 EU/м³ болуы керек және үнемі бақылау жүргізілуі керек.
Жиі кездесетін мәселе | Түбірлі себеп | Шешім |
Стандартты қисықтың нашар сызықтылығы | Эндотоксин стандартын сұйылту кезінде араластырудың жеткіліксіздігі | Эндотоксиннің жұмыс стандартын сұйылту кезінде әр қадамда 30 секундтан астам уақыт бойы құйынды араластырғышты пайдаланыңыз. |
Анықтау нәтижелерінің қайталануы нашар | Біркелкі емес үлгі (ақуыз бетінде адсорбцияланған эндотоксин) | Анықтамас бұрын, үлгіні 60°C су моншасында 10 минут бойы инкубациялаңыз және араластырыңыз (эндотоксинге жоғары температураның әсерінен зақымданудан аулақ болыңыз). |
Қалпына келтіру деңгейі 50%-дан төмен | Кедергілерді жоюдың сәтсіздігі | Үлгіні одан әрі сұйылтыңыз және жоғары сезімталдықты хромогендік реагентті қолданыңыз немесе сұйылтуды және үлгіні қыздыруды біріктіретін алдын ала өңдеу әдісін қолданыңыз |
Жобаны оңтайландыру және болашақ үрдістер
- Әдістемелік интеграция
Тиімділік пен сәйкестікті теңестіру үшін «өндіріс процесінде бақылауға арналған кинетикалық хромогендік әдісті» «соңғы өнімнің бөлінуін анықтауға арналған гель-ұйынды әдіспен» біріктіріңіз;
- Жануарлардан алынбаған әдістерді танымал ету
2. Жануарларды қорғау және тұрақты даму талаптарына сәйкес дәстүрлі LAL әдісін ауыстыру үшін rFC әдісін қолдану.
«Әдіс үйлесімділігі - кедергілерді жою - қатаң сапаны бақылау» үш деңгейлі дизайны арқылы бұл шешім биофармацевтикалық препараттардағы эндотоксиндерді анықтаудың негізгі қиындықтарын нақты шешеді және ғылыми-зерттеу және тәжірибелік-конструкторлық жұмыстардан бастап, өндірістен тіркеуге дейінгі бүкіл өмірлік циклдегі анықтау қажеттіліктерін қанағаттандыра алады, бұл биофармацевтикалық препараттардың қауіпсіздігі үшін негізгі сапа кепілдігін қамтамасыз етеді.